كبديل، قد يكون سجل C57BL/6 ممتازًا شائعًا، نظرًا لكونه أقل سلالات البحث استخدامًا، وتعتمد معظم أنظمة بناء CRISPR على C57BL/6 كجينوم مصدر. يوفر اتحاد تسلسل جينوم الفأر (MGSC) الجديد معلوماتٍ دقيقةً عن الخلافة الجينومية لبناء الحمض النووي للمتبرع. يجب فحص منطقة كل تثبيت مُستهدف بعناية فائقة لتجنب أي مشاكل تنظيمية. على الرغم من استخدام CRISPR، يصعب إنتاج إدخالات أعلى من 5 كيلو بايت في الفئران.

بما في ذلك، لإنتاج أليل ناقض مشروط جيد، يُمكن لحمض نووي واحد من متبرع SS متعدد التكرارات يحتوي على إكسون/إكسونات مُفلكسة أن يُؤدي أداءً أفضل من مجرد استخدام عدد قليل من sgRNAs، وبالتالي الوصول إلى مواقع loxP. ولكن على عكس المتطلبات الفعلية للزيجوت الفأري، يُمكن اختبار تمييز sgRNAs في شبكة العضلات إذا توافرت لدى الفئران المانحة دراسات الكيسة الأريمية الفأرية (Went et al., 2013a). يمكن استخدام أنسجة Es، بما في ذلك (Wang et al., 2013; Yang et al., 2013) لتحديد فعالية تعديل الجينوم قبل الحقن، على سبيل المثال، لأن خلايا Parece تتمتع بكفاءة HDR أفضل من العضلات الجسدية (Yu et al., 2015).

اعتبارات الخروج

بالنسبة للأداء العام لـ sgRNA، فإن هناك قلقًا آخر بشأن تعديل الجينوم، وهو احتمال حدوث طفرات خارج الهدف، خاصةً عند محاولة التعرف على نمط ظاهري جيد للفأر. يوفر تطبيق إطار عمل CRIPSR sgRNA ملخصًا للمواقع المحتملة البعيدة عن الهدف، لذلك، كلما أمكن، سيتم اتباع نهج قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد طفرات الحذف والإدراج في هذه المواقع باستخدام اختبار عدم التطابق الكيميائي. سيُجرى تكاثر فأر بري "نظيف" لفصل الطفرات غير المرغوب فيها (وإن أمكن، سيتم إجراء تهجينين على الأقل لتقليل الطفرات خارج الهدف) (Raveux et al., 2017).

2 قم بإنشاء وسوف تقوم بإنشاء ركيزة خطية بسبب تفاعل البوليميراز المتسلسل

قد يكون تعديل بروتوكولاتنا المتعلقة بالإباضة المفرطة وجمع الزيجوت ضروريًا عند استخدام ضغوط أخرى (Qin et al., 2016). يمكن بدء إنتاج sgRNA وmRNA Cas9 في الزيجوت الفأري إما عن طريق الحقن السيتوبلازمي، باستخدام مُعالج دقيق يعتمد على البيزو، أو عن طريق الحقن النووي، باستخدام مُحقن دقيق (Yang et al., 2014). بشكل عام، لم تُلاحظ أي اختلافات ظاهرية بين أيٍّ من نوعي الولادة (Horii et al., 2014).

لتعديل western union الدفع الجينوم داخل الخلايا الثديية، تُزيل هذه الحذفات جينًا سليمًا نتيجةً لطفرةٍ في الحمض النووي للمانح. ومع ذلك، إذا عُثر على الحمض النووي للمتبرع، فسيتم تصحيح DSB الجديد الذي يحتوي على HDR، وإن كان ذلك بمعدلٍ أقل من NHEJ. تكيفت تقنية CRISPR-Cas9 بعد ذلك للتلاعب الوراثي في الكلاب فقط، مما أدى إلى إنتاج خللٍ وراثيٍّ في الفئران.

يمكن استخدام إعادة التركيب أيضًا لمعالجة الحذف، والطفرات الجزئية، والتضاعف، والانعكاسات، والاندماجات، والعلامات. ركيزة DNA خطية عالية الجودة تحتوي على التغيير المطلوب، وإلا تُنقل التماثلات إلى الحمض النووي المُراد في العضلة. لا يُعدّ Gam ضروريًا لإعادة التركيب، ولكنه يزيد من وتيرة إعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) عند 20-bend. يُجري Exo نوكلياز خارجيًا ثنائي السلسلة (5'→3') ضروريًا لإعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة. بروتينات بيتا الجديدة، وهي بروتين تلدين جيد للحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)، هي إعادة التركيب الرئيسية في عملية إعادة التركيب. والجدير بالذكر أن خدمات إعادة التركيب الآلية، بما في ذلك بروتين إعادة التركيب الدقيق RecA، ضرورية عادةً لإعادة التركيب.

بناءً على الترتيب بعيدًا عن موقع loxP، تُؤدي عملية إعادة التركيب الجيني الجديدة إلى إزالة أو عكس جينات العائلة المستهدفة. نتيجةً للخصائص القابلة للتحريض من cre-loxP، سيحدث الحذف الجديد بسبب مركبات كيميائية، مثل التتراسيكلين والتاموكسيفان. يبدأ التتراسيكلين عملية نسخ cre recombinase الجديدة، بينما يكون التاموكسيفان مسؤولًا عن النقل الذري. تهدف البادئات الجانبية إلى إنشاء شيء ما حيث يقع indel بشكل غير متماثل في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد. سيتم شق أي عدم تطابق بواسطة إنزيم T7E1 (WT – النوع البري؛ HT – متغاير الزيجوت) للمساعدة في تكوين بضع شظايا أصغر في مصل الأجاروز المتحمس.

بينما يُغيّر أوليفاريس وضعية صدره ليدخل في معركة جديدة على يمين كاستيلو، ستُشكّل لكمة كاستيلو اليمنى فوق اليد إطارًا لمنع أوليفاريس من الحصول على ضربة الخطاف السفلي. في وضعية الجسم المُتأهّب، يُوجّه كاستيلو لكمة علوية حماسية لإفساح المجال له للخروج من المعركة، مُعيدًا ضبط نفسه إلى مسافة بعيدة. لكن عندما لم يكن أوليفاريس قادرًا على دخول المعركة على جبهته المعروفة، انخفضت قدرته على اللعب بوصلته المتبقية بشكل كبير.

بالإضافة إلى عمليات الحذف الكبيرة، ثبت أن أعلى ميزات الإدخال الجينومي هي استخدام تقنية كريسبر (تشانغ وآخرون، 2015). ويُقترح استخدام جزيئات sgRNA المزدوجة كوسيلة لزيادة احتمالية استهداف الجين الجديد، خاصةً إذا كان تعديل الجينات ثنائي الأليل مطلوبًا (تشو وآخرون، 2014). وُصفت الطفرات غير المستهدفة في المقام الأول لتعديل جينوم كريسبر في خلايا سرطانية فردية، ولكنها قد تصبح نادرة في الزيجوت الفأري (فو وآخرون، 2013؛ يانغ وآخرون، 2013). ومع ذلك، لا تزال الطفرات غير المستهدفة تُشكل مصدر قلق عند دراسة الفئران المُعدّلة وراثيًا. يؤدي قطع واحد من جين Cas9n إلى كسر في الوتر يُصلح بسهولة؛ وبالتالي، لإنشاء DSB أصلي، يلزم استخدام بعض جزيئات sgRNA. وقد حلت الميزات التقنية لـ CRISPR-Cas9 إلى حد كبير محل استهداف الجينات داخل خلايا باريس كوسيلة لتعديل الجينوم داخل الفئران، على سبيل المثال بسبب البناء الأسهل والوقت المنخفض اللازم للحصول على الفئران المؤسسة.

• نظرًا لأن منطقة دوران الحضرية تشرف على حافة بالومينو، فإن بالومينو غير قادر على رمي الخطاف الأيمن للتقدم.
• حاول موقع EcoRI نسيان إدخال الحمض النووي للمتبرع الخاص بك للمساعدة في استيعاب النمط الجيني للفأر الذي تم إنتاجه بواسطة CRISPR حيث لا يتم تقليل نطاق KI PCR بواسطة Re أيضًا.
• قد تحتاج عمليات الإدراج أو الحذف الأعلى، ولكن ليس أكثر، إلى اثنين من sgRNA لتغطية طول الحمض النووي الجينومي بالكامل الذي سيتم تغييره أو إزالته.
• تحاول أنماط الفئران الشرطية تفضيل دراسة الحالة البشرية لأن بعضها يظهر تشابهًا في النمط الظاهري بينما يتم حذف جينات عائلية محددة.
• تم إنشاء إدخالات بحجم 1-2 كيلوبايت فقط باستخدام CRISPR، لكن النتائج الناتجة عن HDR تقل بشكل أساسي لأن حجم حجم الإدخال الجديد يكبر عن هذا الحجم.

بالإضافة إلى قدرة إنزيم Cas9 على إنزيم نوكلياز الحمض النووي، أُعيد استخدام CRISPR ليشمل بيئةً موجهةً بالحمض النووي الريبوزي (RNA) لإدارة النشاط النسخي الجديد للجينات الموجهة. يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام Cas9 مُعطّل (dCas9) مُدمج مع مُنشّطات النسخ، ومُثبّطات النسخ، ومُعدّلات التخلق (Komor et al. 2017). بدلاً من ذلك، يمكن تنشيط جينات العنوان ذات النمط غير الطبيعي من Cas9 باستخدام sgRNAs ميتة مُعدّلة مُكوّنة من أبتامرات MS2. يتم تقليل هذه sgRNAs الخاملة لإيقاف نمو DSB، حيث توظف أبتامرات MS2 بروتينًا مُركّبًا يحتوي على بروتين غلاف البكتيريا MS2 المُرتبط بمُنشّط نسخي (Liao et al. 2017). لقد ثبت أن تنشيط الجينات المستهدفة يساعد في التخلص من الجينات التي ثبت أنها تساعد في تحسين الأمراض مثل جميع أشكال مرض السكري، وأمراض الكلى، واعتلال العضلات.

تُسرّع عمليات استهداف الجينات هذه، والتطور النهائي لتقنية CRISPR-Cas9، من وقت تطوير فئران مُعدّلة وراثيًا من 8 إلى 10 أسابيع إلى 90 يومًا. ومع ذلك، فقد حلّت تقنية CRISPR-Cas9 محل ZFNs وTALENs في هيكلية وبنية أبسط (الشكل 1). تحتاج ZFNs وTALENs إلى إنشاء نطاقات ربط الحمض النووي متعدد الوحدات لكل هدف جينومي جديد. يستخدم CRISPR إنتاج أحدث ريبونوكليوبروتين من إندونوكلياز الحمض النووي Cas9، وينتج عنه RNA "دليل" ممتاز لتوجيه عملية إنشاء DSB الجينومي باستخدام سلسلة تكميلية منسقة بطول 20 زوجًا قاعديًا.